HUILE MCT ET CRISES D’EPILEPSIE
Contrôle des crises par acide décantoïque par inhibition directe des récepteurs AMPA
Pishan Chang, Katrin Augustin, Kim Boddum, Sophie Williams, Min Soleil, John A. Terschak, Jörg D. Hardege, Philip E. Chen, Matthew C. Walker, Robin S.B. Williams
Brain, Volume 139, Numéro 2, février 2016, Pages 431-443, https://doi.org/10.1093/brain/awv325
Abstrait
Le régime cétogène de triglycéride de chaîne moyenne est un traitement établi pour l’épilepsie pharmacorésistante qui augmente des niveaux plasmatiques d’acide décantique et de cétones. Récemment, l’acide décantoïque a été montré pour fournir le contrôle de saisie in vivo, pourtant son mécanisme d’action reste peu clair. Ici nous montrons que l’acide décantoïque, mais pas les cétones β-hydroxybutyrate ou acétone, montre l’activité d’antiséizure dans deux modèles aigus d’hippocampe . hippocampe de rat d’ex vivo de l’activité épileptiforme. Pour rechercher un mécanisme de l’acide décantique, nous montrons qu’il a un effet inhibiteur fort sur la neurotransmission excitatrice, mais pas inhibitrice, dans l’ hippocampe. Utilisant l’expression hétérologues des sous-unités excitatoires de récepteur de glutamate ionotropique AMPA dans les ovocytes de Xenopus, nous montrons que cet effet est par inhibition directe de récepteur d’AMPA, une cible partagée par un perampanel récemment introduit de traitement d’épilepsie. L’acide décantoïque agit comme un antagoniste non compétitif à des concentrations thérapeutiques pertinentes, d’une manière dépendante de la tension et de la sous-unité, ce qui est suffisant pour expliquer ses effets antiséizure. Cet effet inhibiteur est susceptible d’être causé par la liaison à des sites sur l’hélice M3 du domaine transmembranaire AMPA-GluA2; indépendant du site de liaison de perampanel. Ensemble, nos résultats indiquent que l’inhibition directe de la neurotransmission excitatrice par l’acide décantoïque dans le cerveau contribue à l’effet anticonvulsif du régime cétogène de triglycéride de chaîne moyenne.
Le régime cétogène mct, un traitement établi pour l’épilepsie pharmacorésistante, mène à une élévation de l’acide décantique de plasma et des cétones. Chang et coll. montrent que l’acide décantoïque, plutôt que les cétones, fournit l’activité anti-saisie dans plusieurs modèles ex vivo de rat de l’épilepsie, probablement par l’inhibition directe des récepteurs d’AMPA.
Récepteurs AMPA, acide décantoïque, épilepsie, régime cétogène ,contrôle des crises
Sujet:
Introduction
Le régime cétogène de triglycéride de chaîne moyenne (MCT) a été identifié pour la première fois comme traitement pour l’épilepsie réfractaire en 1971( Huttenlocher et autres,1971). Il a fourni l’une des approches thérapeutiques les plus efficaces pour les enfants atteints d’épilepsie pharmacorésistante (Liu, 2008; Neal et Cross, 2010; Levy et coll.,2012) et a récemment été démontré pour être efficace dans l’épilepsie infantile dans un essai de contrôle randomisé (Neal et coll.,2009). Cependant, le régime a des effets secondaires gastro-intestinaux défavorables connexes, tels que la diarrhée, le vomissement, les ballonnements, et les crampes (Liu, 2008). En outre, il a également été démontré qu’il y a un taux élevé d’attrition pour l’alimentation, en raison de nombreux patients trouvant l’alimentation difficile à tolérer (Levy et coll.,2012). Une compréhension du mécanisme d’action de l’alimentation fournira non seulement un aperçu des mécanismes sous-jacents à l’épilepsie, mais facilitera également le développement de nouveaux médicaments et de thérapies alimentaires mieux ciblées qui sont efficaces dans l’épilepsie pharmacorésistante, mais qui n’ont pas beaucoup d’effets néfastes du régime conventionnel de MCT.
Comprendre le mécanisme thérapeutique de l’alimentation a été difficile (Rho et Sankar, 2008; Rho et Stafstrom, 2011). On a d’abord supposé que la production de cétone était la clé de l’effet antiépileptique du régime, mais il y a une mauvaise corrélation entre les cétones de sérum et le contrôle de saisie (Likhodii et autres,2000; Thavendiranathan et coll.,2000). De plus, les études in vitro et in vivo sur les effets anticonvulsidésants des cétones se sont avérées peu concluantes(Likhodii et coll.,2000; Thavendiranathan et coll.,2000). En plus des cétones, l’alimentation provoque également une augmentation des niveaux plasmatiques des deux acides gras fournis dans l’huile de MCT, la chaîne droite, l’acide décantoïque à 10 carbone et l’acide octoïque à huit carbones(Haidukewych et coll.,1982; Sills et coll.,1986a). Récemment, il a été établi que l’acide décantoïque a des effets antiséizure à des concentrations cliniquement pertinentes in vitro et in vivo (Chang et coll.,2013; Wlaz et coll.,2015) mais l’acide octoïque ne le fait pas, et avec des données pharmacocinétiques in vivo précédentes indiquant que l’acide décantoïque pénètre dans la barrière céphalo-cérébrale(Oldendorf , 1973),ces données suggèrent que l’acide décantoïque contribue directement à l’effet thérapeutique du régime cétogène mct. En effet, in vitro,l’acide décantoïque est plus puissant que l’acide valproïque [un isomer ramé d’acide octanoïque, qui est couramment utilisé dans le traitement del’épilepsie ( Chang et coll.,2013), et qui a été montré pour agir sur la signalisation phosphoinositide dans le contrôle des crises (Xu et coll.,2007; Chang et coll.,2012, 2014a)]. Ainsi, il n’est pas clair si les cétones ou l’acide décantoïque fournissent des effets directs et aigus d’antiséizure pendant l’administration d’un régime de MCT, et par quel mécanisme. Ces questions sont abordées ici.
Matériaux et méthodes
Animaux
Les rats mâles Sprague-Dawley étaient logés dans des cages dans des conditions environnementales contrôlées (24-25°C; 50-60% d’humidité; 12 h de lumière/cycle sombre) avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. Toutes les expériences ont été réalisées sous licences personnelles et de projet approuvées par le Home Office, Londres, Royaume-Uni en vertu des règlements de la Uk Animal (Scientific Procedures) Act, 1986.
Préparation en tranches
Les rats mâles Sprague-Dawley (jours postnatals 19-30) ont été sacrifiés à l’aide d’une surdose d’isoflurane ou de pentobarbitone (500 mg/kg). Après la décapitation, le cerveau a été rapidement enlevé, les tranches d’hippocampe ou de cortex-hippocampe entorhinal ont été disséquées du cerveau et des tranches transversales de 350-μM d’épaisseur ont été préparées sur un vibratome VT1200S (Leica) ou vibratome (Vibratome® 1500 système de sectionnement, Intracell). Le tranchage a été effectué dans la solution glacée à base de saccharose contenant (en mM): 75 saccharose, 87 NaCl, 22 glucose, 2,5 KCl, 7 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2 et 25 NaHCO3, pH 7,4, 315-330 mOsm équilibré avec 95% O2 plus 5% CO2. Les tranches ont ensuite été stockées dans une chambre de détention humidifiée en continu contenant du CSF artificiel oxygéné (en mM) : 120 NaCl, 22 glucose, 2,5 KCl, 1,3 MgSO4, 1 NaH2PO4, 25 NaHCO3 et 2,5 CaCl2, pH 7,4 296 mOsm, où ils ont récupéré pendant au moins 1 h avant utilisation.
Électrophysiologie
Modèle de saisie in vitro
Au cours de l’expérience, les tranches ont été transférées de la chambre d’interface dans une chambre d’enregistrement submergée, conçue pour optimiser le lavage et le lavage des médicaments, et continuellement perfusées à l’aide d’aliments par gravité à 3-6 ml/min avec du CSF artificiel oxygéné préchauffé (36 °C) (95 % O2, 5 % de CO2). Des potentiels de champ ont été enregistrés avec un microélectrode en verre (1-2 MΩ) rempli de solution artificielle de CSF placée dans le radiatum de strate de CA1 et ont été filtrés à 1 kHz et numérisés à 2 kHz (utilisant un amplificateur extracellulaire npi EXT-02F enregistré avec le logiciel WinEDR). Dans le modèle pentylenetetrazol, l’activité épileptiforme (paroxysmale) a été induite par l’application du pentylenetetrazol (2 mM) au perfusâtes et [K] a été augmentée (à 6 mM); en faible mg+2+ modèle, l’activité épileptiforme a été obtenue en utilisant Mg2+-CSF artificiel gratuit. Une fois que la fréquence de l’activité paroxysmale était stable pendant au moins 10 min, des composés ont été appliqués au perfusâtes pendant les 40 minutes suivantes, et lavés pendant 20 minutes restantes. Les effets anticonvulsivants ont été évalués en mesurant le changement dans la fréquence des décharges à intervalles minute. La fréquence de décharge a ensuite été moyenne toutes les 5 minutes pendant l’expérience et normalisée à la ligne de base. Les composés appliqués dans cette étude comprenaient : 1 % de sulphoxide diméthyle (DMSO), d’acétone (10 mM, Sigma), (±)-sodium 3-hydroxybutyrate (BHB) (10 mM, Sigma) et d’acide décantoïque (1 mM, Alfa Aesar Pty). L’acétone et les acides decanoïques ont été préparés sous forme de stocks de 1000 × dans le DMSO, et BHB a été préparé en stock de 100 ×. Les stocks ont été dissous dans le CSF artificiel pour atteindre leurs concentrations finales au cours des expériences, et le cas échéant, les expériences comprenaient des niveaux constants de DMSO.
Pince à patch à cellules entières
Pour l’enregistrement électrophysiologique, les tranches ont été placées dans une chambre d’enregistrement constamment perfusée avec la solution artificielle oxygénée de CSF de 32-34°C utilisant un système de perfusion par gravité. Des enregistrements de pince de correction de cellules entières ont été exécutés sur des cellules pyramidales CA1 (résistance d’entrée 330 ± 70 MΩ) visualisées à l’aide d’un système infrarouge d’imagerie différentielle de contraste. Pour le patchage, des pipettes en verre borosilicate murées standard avec une résistance de 2,5-3,5 MΩ ont été utilisées, remplies d’une solution intracellulaire de pipette contenant (en mM): 120 Cs-méthanesulphonate, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 8 NaCl, 0.2 MgCl2, 2 Mg-ATP, 0.3Na-GTP, 5 QX314-Br, 10 phosphocreatine, pH ajusté à 7.2 et osmolalité ajustée à 296 mOsm. La résistance de série a été surveillée tout au long des expériences utilisant une commande d’étape de −5 mV et les cellules montrant un changement de >20% dans la résistance de série, une série de résistance de >20 MΩ ou un courant de fixation instable ont été rejetées. Des enregistrements de courants postsynaptiques excitatifs (EPSC) ont été réalisés en présence de DL-APV (D l-2-amino-5-phosphonopentanoic; 100 μM), picrotoxine (100 μM) et CGP55845 (5 μM) pour bloquer les récepteurs NMDA-, GABAA– et GABA B, respectivement. L’acide décantoïque (Sigma) a été ajouté à la solution de perfusion. Les CPE ont été évoqués par la stimulation des garanties Schaffer. Des impulsions jumelées ont été évoquées avec des stimulations séparées par 50 ms. Le courant postsynaptique inhibiteur (IPSCs) a été enregistré en présence de DL-APV (100 μM), NBQX (10 μM) et CGP55845 (5 μM) pour bloquer les récepteurs NMDA-, AMPA- et GABA B, respectivement.
Les enregistrements ont été obtenus à l’aide d’un amplificateur MultiClamp 700B (instruments Axon) et filtrés à 4 kHz, numérisés à 10 kHz et stockés sur un PC. LabView8 (Instruments nationaux) a été utilisé pour l’acquisition de données et l’analyse hors ligne.
In vitro Transcription de l’ARN des sous-unités de récepteurs AMPA
Les adnas récepteurs AMPA (flip isoforme) insérés dans un vecteur d’expression de polymérase SP6 (pSP6T) étaient un don généreux du Professeur Ralf Schoepfer (NPP, UCL). L’ARN a été transcrit in vitro à partir de transcriptions linéarisées MluI à l’aide de la trousse de synthèse de l’ARN SP6 Promega Ribo MAX® selon les protocoles du fabricant, à l’exception de l’ajout de 0,75 mM plafonner le nucléotide m7G(5′)ppp (5′)G (Promega) et 1.6 mM GTP. Les concentrations et l’intégrité de l’ARN ont été estimées par l’intensité des bandes de fluorescence dans les gels dénaturants de l’ARN. Les ARN récepteurs AMPA ont été mélangés dans un rapport nominal de 1:1 et ∼5 ng ont été injectés par ovocyte.
Préparation et injection d’ovocytes
Les ovocytes Xenopus laevis ont été achetés auprès du Centre européen de ressources Xenopus de l’Université de Portsmouth. Les ovocytes de stade V à VI ont été disséqués mécaniquement, puis soumis à de douces secousses pendant ∼30-50 min à température ambiante avec la solution modifiée de Barth (en mM): 88 NaCl, 1 KCl, 2,4 NaHCO3, 0,82 MgCl2, 0,77 CaCl2, 15 Tris-Cl, ajusté au pH 7,4 avec NaOH (Sigma-Aldrich), complété par 50 UI/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine (Invitrogen) et 50 μg/ml de tétracycline (Sigma-Aldrich) et 1% de collagène (type 1A). Les ovocytes sains ont été désfolliculés manuellement et les injections d’ARN pour les sous-unités homomériques seules (GluA1), ou les mélanges hétéromériques de deux sous-unités ensemble (GluA1/GluA2 ou GluA2/GluA3) ont été faites à l’aide d’un injecteur automatisé Drummond Nanoinject II. Les ovocytes ont ensuite été incubés à 17 °C dans la solution modifiée de Barth pendant au moins 48 h avant d’être utilisés dans des enregistrements électrophysiologiques.
Enregistrements de pince de tension à deux électrodes à partir d’ovocytes
Des expériences ont été réalisées à température ambiante (∼21-23°C). Un ovocyte a été placé dans une chambre d’enregistrement (0,3-0,5 ml de volume) et perfusé avec la solution ND96 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCI2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, avec pH ajusté à 7,5). Les électrodes actuelles et de tension étaient remplies de KCl de 300 mM et fabriquées à partir de verre borosilicate à paroi mince (GC150TF-7.5, Appareil Harvard) à l’aide d’un pull d’électrode PC-10 (Narashige Instruments) et avaient des résistances de 0,5 à 2 MΩ. Les ovocytes ont été attachés à une tension à un potentiel de détention de −50 mV ou −60 mV à l’aide d’un amplificateur Turbo TEC-03 (électronique npi). Les composés ont été dissous dans de l’eau distillée ou DMSO et dissous dans la solution de bain pour atteindre leurs concentrations finales au cours des expériences, et ont été appliqués sous flux gravitationnel au cours de l’expérience à l’aide d’un système de perfusion multi-valves (VC3-8C, ALA Scientific Instruments). Les solutions de bain ont été perfusées à un taux de 10 ml/min. Les enregistrements ont été filtrés à 20 Hz et numérisés à 100 Hz (Digidata 1322A, Molecular Devices) avant d’enregistrer sur disque dur de l’ordinateur. L’acquisition de données a été effectuée à l’aide du programme Windows PC, WinEDR v3.0.6 (John Dempster, Université de Strathclyde, Royaume-Uni).
Études de dynamique moléculaire
Le format SMILES de chaque ligand a été converti en fichiers PDB 3D à l’aide d’Open Babel (Ver. 2.3.2). La fonction obconformer a ensuite été utilisée pour trouver la conformation énergétique la plus basse de 5000 conformistes d’essai après 100 étapes d’optimisation de la géométrie. Une molécule réceptrice GluA2 (Protein Data Bank Code 3KG2) téléchargée à partir du Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RSCB PDB) a été traitée à l’aide d’Auto-Dock (Ver 1.5.6) dans lequel des molécules d’eau solvant, des sous-unités en double (B, C, et D), et les ligands liés (zinc, β1.5.6) dans lesquels des molécules d’eau solvant, ΖΚ1 [7-morpholin-4-yl-2,3-dioxo-6-(trifluoromethyl)-3,4-dihydroquinoxalin-1 (2H)-yl]methyl}phosphonic acid)] ont été enlevés. Les hydrogènes polaires ont été conservés après l’ajout des charges kollman et la répartition du déficit de charge. En commençant par le ligand dans sa conformation énergétique la plus basse, chacun a ensuite été autorisé à tourner librement sur ses liaisons simples pendant le processus d’amarrage. Pour 3KG2, la grille d’amarrage a été réglée dans une boîte de 126 unités centrée à x: 16.971, y: 40.698, et z: −106.466 avec 0.528 Å espacement; cela englobe l’ensemble du domaine transmembranaire de la sous-unité A (Fig. supplémentaire 6). Les paramètres de recherche d’amarrage utilisaient l’algorithme génétique d’Auto Dock avec 25 séries de 2,5 millions d’évaluations et une taille initiale de la population de 250. À la fin de l’amarrage de chaque ligand, le nombre de conformations ainsi que la portée de leurs énergies de liaison ont été notés pour chaque amas d’emplacements d’amarrage. Les résidus d’acides aminés dans les 6 Å de la conformation énergétique la plus basse de chaque ligand lié ont été notés. Les résidus participant le plus fréquemment à la liaison avec les différents ligands ont été ciblés comme le site de liaison le plus probablement commun pour 3KG2 (Figue supplémentaire 3).
Analyse statistique
Les données des expériences d’électrophysiologie ont été analysées à l’aide du logiciel Graph Pad Prism et du SPSS (IBM) avec des valeurs IC50 calculées à l’aide de y = 100 / (1 + 10(X − logIC50)). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’ANOVA avec test post-hoc Tu key, t-test apparié ou t-test non apparié.
Résultats
L’acide décantoïque, et non les cétones, inhibe particulièrement l’activité épileptiforme
Nous avons d’abord évalué si les effets aigus d’antiséizure du régime cétogène de MCT sont liés à un effet direct des corps décantique d’acide ou de cétone (β-hydroxybutyrate et acétone). Ici, nous avons utilisé deux modèles in vitro différents d’activité épileptiforme générés par la diminution de l’inhibition gabaergique (pentylenetetrazol)(fig. 1A-C) ou la potentialisation des courants récepteurs NMDA (faible magnésium) (Fig. 1D-F). Dans les deux modèles, même à des concentrations élevées (10 mM), les corps cétones n’ont eu aucun effet sur l’activité épileptiforme. En revanche, à une concentration à laquelle l’acide valproïque, un acide gras à chaîne ramée et un médicament antiépileptique établi de longue date, ne modifie que l’activité épileptiforme dans ces modèles (1 mM) (Chang et coll.,2012, 2013), l’acide décantoïque a complètement bloqué l’activité épileptiforme dans les deux modèles (Fig. 1). Ceci soutient un effet antiséizure de la composante acide décantique du régime de MCT, plutôt que des cétones diet-dérivées.
Figure 1
L’acide décantoïque mais pas les cétones réduisent l’activité épileptiforme dans deux modèles aigus d’ex vivo. L’activité épileptiforme a été surveillée à l’aide de deux modèles ex vivo de tranches hippocampiques de rat, après traitement à l’acide décantoïque (DA, 1 mM) ou à l’acétone de cétone et au β-hydroxybutyrate (BHB) (tous deux à 10 mM) ou avec solvant seulement (contrôle). (A) Exemple d’enregistrement de traces d’activité épileptiforme (décharges éclatées) dans des tranches hippocampiques induites par l’application de pentylenetetrazol (PTZ, 2 mM, K 6 mM), un modèle pour les saisies généralisées, et après traitement, où (B) la fréquence de l’activité épileptiforme est tracée contre le temps, après traitement, et également montré comme une comparaison de la fréquence moyenne (±SD) des décharges d’éclatement moyenne de 20 à 40 min addition post-composé. (C) Exemple d’enregistrement de traces d’activité épileptiforme (décharges d’éclatement) dans les tranches hippocampiques induites par faible mg+2+ comme modèle pour les crises pharmacorésistante, et après le traitement, où (D) la fréquence de l’activité épileptiforme est tracée contre le temps, et également montré comme une comparaison de la fréquence moyenne (±SD) des décharges d’éclatement moyenne de 20 à 40 min addition post-composé. Importance indiquée par ***P < 0,001 par rapport au contrôle (ANOVA avec test post-hoc Tukey). Toutes les données ont été normalisées à la ligne de base. Les données sont fournies entre n = 4 et 7 répétitions.
L’acide décantique inhibe particulièrement les courants postsynaptiques excitatifs
Nous avons ensuite demandé quels sont les mécanismes moléculaires pour l’effet de l’acide décantoïque dans le contrôle des crises sont susceptibles d’être. Comme la plupart des médicaments antiépileptiques modifient la transmission synaptique ou l’excitabilité neuronale, nous avons d’abord testé l’effet de l’acide décantoïque sur la neurotransmission excitatrice ou inhibitrice en déterminant l’effet de l’acide décantoïque sur les CPE et les CISP évoqués dans les tranches hippocampes aiguës ex vivo. Pour ces expériences, nous avons effectué des enregistrements de pinces patch à cellules entières à partir de neurones pyramidaux CA1 et stimulé la strate radiatum en présence de NMDA-, GABAA– et GABAB-inhibiteurs des récepteurs pour isoler les EPSC à récepteur AMPA ou en présence de NMDA-, Les bloqueurs de récepteurs AMPA- et GABA B pour isoler les CISP à récepteur GABAA et ont appliqué de l’acide décantique de 300 μM (52 μg/ml) [semblable à la concentration maximale de sérum chez les enfants sous l’alimentation MCT ( Silles et coll.,1986a), ainsi qu’aux concentrations sériques et cérébrales nécessaires aux effets de crise aiguë chez la souris(Wlaz et coll.,2015)]. L’acide décantoïque a diminué l’amplitude de l’EPSC de 38,9 ± de 5,5 %, (n = 6 ; P < 0,001; Fig. 2 A et C), mais n’a eu aucun effet significatif sur les CISP évoqués (fig. 2B et D). En outre, l’acide décantoïque (300 μM) n’a eu aucun effet sur 1/CV2 (CV, coefficient de variation) pour les CPE (acide décantoïque par rapport à la ligne de base; n = 6: P = 0,95; Fig. 2 E) ou IPSCs (acide décantoïque par rapport à la ligne de base; n = 6: P = 0,95; Fig. 2 F), et n’a pas affecté le rapport d’impulsion apparié pour epscs (acide décantoïque par rapport à la ligne de base ; n = 6; P = 0,69 Supplementary Fig. 1 A et B), compatible avec un lieu d’action postsynaptique. À une concentration comparable à l’état stable d’acide décantique chez les enfants qui suivre un régime alimentaire (100 μM) (Silles l’acide décantoïque a encore considérablement réduit les amplitudes epsc de 17,0 ± 5,6%(P = 0,01; n = 6). Nos résultats sont donc compatibles avec un effet significatif (direct ou indirect) de l’acide décantoïque sur l’activité des récepteurs excitatifs postsynaptiques (AMPA).
Figure 2
L’effet de l’acide décantoïque sur les CPE et les CISP. Des courants ont été enregistrés des cellules pyramidales hippocampe de CA1 suivant l’exposition à l’acide décantique (DA ; 300 μM). (A) Les enregistrements électrophysiologiques représentatifs montrent l’amplitude évoquée réduite d’EPSC suivant l’application de l’acide décantique. L’insert fournit la moyenne de 10 traces de la même cellule indiquant la forme des CPE simples avant (1), pendant (2) et après (3) l’application d’acide décantoïque. (B) Les enregistrements électrophysiologiques représentatifs ne montrent aucun effet de l’acide décantique sur les CISP. (C) Données sommaires montrant l’effet de l’acide décantoïque sur les CPE normalisés ± SEM(n = 6). (D) En revanche, l’acide décantoïque n’a eu aucun effet sur les CISP normalisés ± SEM (n = 6). L’acide décantique n’a pas changé 1/CV2 (CV, coefficient de variation) des amplitudes EPSC (E) ou IPSC (F) avec des moyens ± SEM traitement acide pré et post-décantoïque comme indiqué, compatible avec un locus post-synaptique d’action.
L’acide décantoïque inhibe directement l’activité des récepteurs AMPA
Pour déterminer si l’acide décantoïque a un effet direct sur l’activité des récepteurs AMPA, nous avons employé un système d’expression hétérologique dans lequel des sous-unités de récepteur ampa (GluA2/3) ont été exprimées dans les ovocytes Xenopus et les courants intérieurs provoqués par l’agoniste ont été utilisés pour tester l’activité inhibitrice de l’acide décantoïque. Dans ces expériences, nous avons mesuré l’effet de l’acide décantoïque, de l’acide octoïque et de l’acide valproïque (le tout à 1 mM; n = 12), sur les courants obtenus par l’application de 100 μM L-glutamate. Conformément à son efficacité anticonvulsivant (Chang et coll.,2012, 2013), l’acide décantoïque a nettement réduit les courants récepteurs ampa (32,4 ± 2,0 % du contrôle, n = 24, P < 0,001; Fig. 3 A et B), tandis que l’acide octoïque n’a eu aucun effet. L’acide valproïque n’a également montré aucune action sur les courants récepteurs AMPA. Les courbes inhibitrices dose-réponse ont montré que l’effet de l’acide décantoïque dépendait de la dose(fig. 3C et D), et plus puissant (IC50 moyen = 0,52 ± 0,02 mM, n = 12) que celui de l’acide octoïque (IC50 moyen = 3,82 ± 0,03 mM, n = 10). L’inhibition du glutamate suscitée vers l’intérieur par l’acide décantique a également été observée chez les ovocytes exprimant les canaux homomériques GluA1(fig. 3E et F). L’acide décantoïque a également inhibé les récepteurs AMPA après activation avec l’agoniste sélectif des récepteurs AMPA à haute affinité, AMPA (30 μM; 16,7 ± 2,7 % de l’AMPA seulement; n = 8; P < 0,001) (Supplémenter). Cet effet inhibiteur indique une inhibition directe et structurellement spécifique des courants récepteurs ampa par l’acide décantique.
Figure 3
L’effet direct de l’acide décantoïque sur les courants médiés par les récepteurs AMPA. Dans ces expériences, les ovocytes Xenopus ont été utilisés pour exprimer les récepteurs AMPA (GluA2/A3 ou GluA1), et les courants ont été mesurés après application de L-glutamate (100 μM) avec un potentiel membranaire attaché à −50 mV. (A) Enregistrements représentatifs des traces de GluA2/3, montrant l’effet des acides gras à chaîne moyenne acide décantoïque (DA), acide octanoïque (OA) et VPA (tous à 1 mM) et de l’inhibiteur des récepteurs AMPA CNQX (30 μM) sur les courants intérieurs; et (B) résumé des courants normalisés moyen (±SEM). (C) Traces actuelles représentatives des courbes inhibitrices dose-réponse pour l’acide octoïque ou décantoïque. (D) Courbes inhibitrices moyennes dose-réponse pour l’acide octoïque ou décantoïque, les graphiques montrent signifie ± SEM. (E) Enregistrements représentatifs des traces pour GluA1, montrant l’effet des acides gras à chaîne moyenne et VPA sur les courants intérieurs. (F) Résumé des courants normalisés moyen (±SEM). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’ANOVA avec le test post-hoc de Dunnett. *P < 0,05, ***P < 0,001, par rapport au contrôle; P < 0,001, comparativement au solvant seulement (DMSO). Barres d’échelle = 15 nA pour l’acide octoïque et 5 nA pour l’acide décantique.+++
Nous avons ensuite étudié si l’inhibition des récepteurs AMPA pouvait bloquer l’activité épileptiforme in vitro en utilisant le modèle de saisie d’hippocampe/pentylenetetrazol. Ici nous avons examiné si GYKI 52466—un antagoniste non concurrentiel de récepteur d’AMPA-à une concentration qui donne le même degré d’antagonisme de récepteur d’AMPA que l’acide décantoïque de 1 mM(Arai, 2001). GYKI 52466 (50 μM) a complètement bloqué l’activité épileptiforme in vitro induite par le pentylenetetrazol (fig. 4), indiquant que l’antagonisme récepteur AMPA de l’acide décantoïque est suffisant pour expliquer son effet pharmacologique in vitro.
Figure 4
L’effet de l’antagonisme de récepteur d’AMPA avec GYKI 52466 sur l’activité épileptiforme. L’activité épileptiforme induite par l’application du pentylenetetrazol (2 mM, K 6 mM) a été surveillée après traitement avec l’antagoniste sélectif des récepteurs AMPA GYKI 52466 à une concentration (50 μM) qui se traduit à peu près la même (∼60-70%) diminution des réponses des récepteurs AMPA (± SD) comme on l’observe avec l’acide décantoïque de 1 mM(n = 4).+
Nous avons déjà observé que la modification chimique des acides gras à chaîne moyenne peut augmenter leur puissance contre les multiples modèles de saisie in vitro et in vivo (Chang et coll.,2012, 2013, 2014a). Par exemple, bien que l’acide octoïque montre peu de contrôle de saisie dans ces modèles, un dérivé ramé, acide 4-méthyloctanoic est fortement actif. Nous avons donc examiné la puissance de l’acide 4-méthyloctanoïque pour l’activité inhibitrice aux récepteurs AMPA (GluA2/3) (Fig. 5). Ce composé a montré une forte activité inhibitrice [IC50 0,84 ± 0,04 mM (n = 14)], compatible avec celle montrée pour le contrôle des crises. Ces données sont compatibles avec les dérivés d’acides gras à chaîne moyenne fournissant l’inhibition directe de récepteur d’AMPA relative au contrôle de saisie.
Figure 5
L’effet de l’acide 4 éthyloctanoïques sur ampa (GluA2/A3) courant médié dans les ovocytes Xenopus induits par le L-glutamate. (A) Enregistrement représentatif des traces montrant l’effet de l’acide 4 éthyloctanoïques à des concentrations indiquées sur le courant AMPA (GluA2/A3) suivant l’application du glutamate (100 μM). (B) Courbes inhibitrices dose-réponse de l’acide 4 éthyloctanoïques (n = 4) en présence de glutamate (100 μM), avec des données présentes comme moyens ± SEM. Les réponses sont normalisées à la réponse actuelle maximale induite par l’application de L-glutamate pour chaque enregistrement.
L’inhibition de l’acide décantoïque de l’activité des récepteurs AMPA dépend de la sous-unité, n’est pas compétitive et dépend de la tension
Nous avons ensuite exploré la sous-dépendance de l’inhibition de l’acide décantoïque sur les récepteurs AMPA. Nous avons employé des ovocytes exprimant un homomérique (sous-unité GluA1), et hétéromériques (récepteurs AMPA GluA1/2 et GluA2/3) et les courants mesurés suivant le traitement de glutamate (100 μM). Semblable aux expériences précédentes, l’acide décantique a eu un effet inhibiteur puissant sur les récepteurs ampa homomériques de GluA1(fig. 6A et B ; IC50 = 2,09 mM; P < 0,001 par rapport au solvant seulement), tandis que l’acide octoïque et l’acide valproïque n’ont eu aucun effet. La puissance de l’acide décantoïque était plus grande au complexe hétéromériques GluA1/2(fig. 6A et B; IC50 = 1,16 mM; P < 0,001 par rapport à l’homomère GluA1), et encore plus au complexe hétéromériques GluA2/3(fig. 6A et B; IC50 = 0,52 mM; P < 0,001 par rapport à GluA1/2 hétéromère). Ceci suggère que l’acide décantoïque soit un inhibiteur large de récepteur d’AMPA de spectre, mais avec la puissance différente aux combinaisons spécifiques de sous-unité.
Figure 6
Caractérisation de l’inhibition des récepteurs AMPA dépendants de l’acide décantique. Dans ces expériences, des ovocytes de Xenopus ont été utilisés pour exprimer diverses combinaisons de récepteur d’AMPA, et des courants glutamate-obtenus ont été mesurés en présence des concentrations variables d’acide décantique. (A) Trace actuelle représentative montrant différentes combinaisons de sous-unité des récepteurs AMPA (GluA1; GluA1/2; GluA2/3) après exposition à différentes concentrations d’acide décantique (0,001, 0,05, 0,3, 0,7, 1 et 3 mM) sur l’application actuelle suivante de glutamate (à 100 μM). Barres d’échelle = 200 nA pour GluA1 et GluA1/2; 20 nA pour GluA2/3, et (B) courbes inhibitrices moyennes dose-réponse de l’acide décantique de différentes combinaisons de récepteurs AMPA(inset fournit des valeurs IC50) (n = 12). (C) Traces représentatives d’enregistrements électrophysiologiques montrant l’effet du glutamate (0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 mM) sur les courants GluA2/3 en présence d’acide décantoïque (à 0,3 mM ou 1 mM). Barre d’échelle = 5nA (pas d’acide décantoïque); 2 nA (acide décantoïque de 0,3 mM); et 4 nA (acide décantoïque de 1,0 mM). (D) Évaluation quantitative de la puissance de l’acide décantique par rapport aux courants GluA2/3 montrant des courbes moyennes de concentration-réponse au glutamate(n = 5 pour chaque traitement) où les réponses sont normalisées au courant maximal pour chaque enregistrement en l’absence d’acide décantique. (E) Trace actuelle représentative des courbes inhibitrices dose-réponse pour l’acide décantoïque en présence de glutamate (100 μM; n = 20 et 1 mM; n = 6) pour les récepteurs GluA2/3 et (F) les courbes inhibitrices moyennes dose-réponse pour l’acide décantoïque contre GluA2/3 en présence de 100 μM ou 1 mM de glutamate montrent peu de changement, suggérant une inhibition non compétitive du courant médié ampa en ce qui concerne le glutamate. (G) Traces actuelles représentatives de la dépendance à la tension de l’activité inhibitrice de l’acide décantoïque, où les courbes d’inhibition de l’acide décantique dans le présent du glutamate (100 μM) pour les récepteurs GluA2/3 avec tension serrée à −80 et −40 mV. Barres d’échelle = 200 nA et 20 nA, respectivement. (H) Courbes inhibitrices moyennes dose-réponse à −80 et −40 mV(inset fournit des valeurs IC50) ( n= 6).
Nous avons étudié plus loin la nature de l’inhibition de récepteur d’AMPA acide-dépendante de décantation. Nous avons mesuré les courbes dose-réponse du glutamate en l’absence et la présence de 0,3 mM ou d’acide décantoïque de 1 mM à l’aide de GluA2/3(fig. 6C et D). On prévoit que l’inhibition concurrentielle déplacera les courbes dose-réponse vers la droite (augmentant l’EC50 mais avec la même réponse maximale). Cependant, en revanche, nous avons observé une réduction significative des EC50 moyenne pour le glutamate en présence d’acide décantoïque par rapport au contrôle [de 0,029 mM pour le contrôle à 0,015 mM et 0,018 mM pour 0,3 mM (P < 0,001) et 1,0 mM(P < 0,01) acide décantique, respectivement; Fig. 6 D] et aussi une réduction marquée de la réponse maximale à l’augmentation des concentrations d’acide décantique. De telles observations indiquent que l’acide décantoïque affiche une inhibition non compétitive aux récepteurs AMPA. En outre, nous avons également comparé les IC50 moyen d’acide décantique en présence de faibles concentrations de glutamate (100 μM) et de glutamate (1 mM) élevées(fig. 6E et F). L’application d’acide décantoïque a entraîné une réduction dépendante de la concentration du courant récepteur AMPA induit par le glutamate (100 μM) avec une valeur IC50 de 0,52 ± 0,02 mM(n = 12; Fig. 6 E et F). Répéter ces expériences à des concentrations plus élevées de glutamate (1 mM) n’a pas modifié l’effet inhibiteur (0,54 ± 0,03 mM, n = 10; Fig. 6 E et F), suggérant que l’inhibition de l’acide décantoïque n’est pas inversée par des concentrations plus élevées de glutamate et agit comme un inhibiteur non compétitif des récepteurs AMPA. Ceci indique que l’acide décantoïque est susceptible de se lier à une région différente des récepteurs d’AMPA de celui à laquelle le glutamate lie, et que ce mécanisme inhibiteur peut être partagé entre un certain nombre d’acides gras avec l’activité anti-saisie.
Nous avons ensuite étudié la tension-dépendance de l’inhibition directe de récepteur d’AMPA par l’acide décantique utilisant GluA2/3. Ici, nous avons serré la tension à travers la membrane d’ovocyte à différents potentiels de membrane, et avons examiné des changements dans l’activité inhibitrice de l’acide décantoïque sur le courant AMPA-dépendant qui peut se produire pendant la dépolarisation synaptique. Dans ces expériences, l’acide décantoïque montre une inhibition accrue de l’AMPA au potentiel membranaire plus dépolarisé, −40 mV, où l’IC50 est de 0,43 ± 0,09 mM(n = 6) par rapport à −80 mV, où l’IC50 est de 1,11 ± 0,05 mM(n = 6) (Fig. 6G et H).
L’acide décantique se lie dans le canal des récepteurs AMPA
Nous avons ensuite cherché à identifier un site de liaison potentiel pour l’acide décantique dans le récepteur AMPA en utilisant une approche de modélisation avec le récepteur AMPA sensible, homotétramérique, rat GluA2 (3KG2). Dans l’analyse silico a été utilisé pour évaluer la liaison de l’acide décantique et perampanel dans le domaine transmembrane de 3KG2 (Morris et coll., 2009), où plus de 2,5 millions de confirmations d’acide décantique et 3KG2 ont été évaluées, et les 25 conformations produisant l’énergie de liaison la plus faible ont été utilisées pour définir des emplacements contraignants spécifiques dans le récepteur. À partir de ceux-ci, la fréquence des résidus individuels d’acides aminés participant à la liaison (c.-à-d. dans les 6 Å d’acide décantoïque) a été déterminée (Figue supplémentaire 3). Les résidus les plus fréquents impliqués dans la liaison des résidus de travée d’acide décantique 584-590 (Fig. 7A et B) (Figue supplémentaire 3). Cela coïncide avec l’hélice M3 du domaine transmembrane et, plus précisément, ces résidus qui influencent le courant intérieur à travers le récepteur et que l’on pense impliqués dans le gating. Nous avons également examiné le site pour perampanel, un traitement récemment introduit pour des saisies partielles de début et montrant l’efficacité dans l’épilepsie pharmacorésistante (Russo et autres,2012; Rektor, 2013). Notre approche de modélisation prévoyait que perampanel se lierait à une région à la frontière entre S1 et le chenal, conformément à celle identifiée dans d’autres rapports ( Szenasi et coll.,2008; Rogawski, 2011). Ces données suggèrent que l’acide décantoïque se lie directement au canal récepteur ampa, à un endroit distinct de celui du perampanel, et peut donc présenter un effet physiologique différent au perampanel.
Liaison acide décantoïque des récepteurs AMPA. Une approche de modélisation moléculaire a été adoptée pour étudier les sites contraignants d’acide décantoïque sur les récepteurs AMPA en utilisant la configuration des protéines actives (3KG2) de GluA2 et les résidus de modélisation dans les 6 Å du ligand. (A) L’acide décantoïque est prévu pour se lier dans la région du canal du récepteur (magenta) sur les hélices M3 (structure globale montrée dans l’encart). En utilisant cette approche de modélisation, l’agoniste des récepteurs AMPA connu, perampanel, devrait se lier à la région linker entre le domaine de liaison glutamate S1 et le pore du canal (bleu). (B) Vue du côté intracellulaire vers le bas de l’axe du pore du canal iion. La molécule remplie d’espace est l’acide décantoïque (carbones de magenta et deux molécules rouges d’oxygène acide carboxylique) liant à Pro584 (vert) d’une sous-unité avec la liaison équivalente de l’acide décantique aux trois autres sous-unité omis pour plus de clarté.
Discussion
Le mécanisme prédominant des régimes cétogènes, comme son nom l’indique, a été largement considéré comme étant par la production des corps de cétone(Bough et Rho, 2007; Rho et Stafstrom , 2011), comme le 3-hydroxybutyrate et l’acétoacétate, puisque ceux-ci se trouvent être élevés dans le plasma des patients sur le régime(Huttenlocher, 1976). Cependant, une corrélation entre les niveaux de cétone de sang et le contrôle de saisie dans les patients et les modèles animaux n’a pas été uniformément trouvée(Thavendiranathan et autres,2000). Notre étude suggère que l’acide décantoïque, plutôt que les cétones, puisse fournir le mécanisme moléculaire direct du régime cétogène de MCT, dans deux modèles ex vivo pour l’épilepsie pharmacorésistante, bien que les cétones soient susceptibles de fournir d’autres avantages (Bough et Rho, 2007; Rho et Sankar 2008; Rho et Stafstrom, 2011; Kim et coll.,2015). Ceci est également soutenu par d’autres études montrant que les corps de cétone ne modifient pas directement la transmission synaptique hippocampique excitatrice ou inhibitrice (Thio et autres., 2000) ni affecter l’activité épileptiforme (activité interictale ou ictale) induite par 4-aminopyridine dans les tranches hippocampe-entorhinal cortex (Thio et coll.,2000), bien que les cétones ont été montrés pour moduler l’activité vésculaire transporteur de glutamate à des sites présynaptiques (Juge et coll.,2010). Néanmoins, il peut y avoir des circonstances, où les cétones jouent un plus grand rôle comme dans l’insuffisance de Glut1, dans laquelle les cétones du régime cétogène fournissent au cerveau une source d’énergie alternative ( Veggiotti et De Giorgis, 2014). En outre, le régime cétogène à plus long terme peut modifier l’expression métabolique et génique, qui pourrait avoir des effets importants modificateurs de la maladie ( Masino et coll.,2011; Kim et coll.,2015). En outre, le régime cétogène (avec le glucose réduit) diminue des concentrations cellulaires de pyruvate/oxaloacétate, qui a été récemment montré pour hyperpolariser des neurones par un effet sur des courants neuronaux de potassium (Sada et autres,2015).
Le classique (triglycéride à longue chaîne; LCT) régime cétogène, qui s’est montré aussi efficace que le régime mct (Neal et coll.,2009), fournit jusqu’à 90% des calories dans l’alimentation que la graisse et est extrêmement restrictive. En revanche, le régime mct permet moins d’énergie à fournir comme graisse totale (résultant généralement en un apport total en graisses de 65-75% d’énergie) permettant un régime moins restrictif et plus varié. L’implication de nos résultats pour le mécanisme d’action pour le régime classique n’est pas encore explorée ; cependant, les graisses à longue chaîne sont métabolisées en graisses de chaîne plus courtes et on s’attendrait donc à ce que les graisses de la chaîne moyenne sérique soient augmentées. De futures études pour surveiller les niveaux moyens d’acides gras du cerveau dans les modèles animaux et dans le plasma patient pendant les régimes cétogènes seront nécessaires pour déterminer le rôle des acides gras dans le contrôle des crises.
L’acide décantoïque est un constituant important du régime cétogène de MCT, fournissant ∼40% de la graisse moyenne de chaîne dans le régime ( Sills et autres,1986a). Même si l’acide décantoïque est largement métabolisé en dioxyde de carbone, en cétone et en acides gras à longue chaîne, il a été signalé qu’il existe des concentrations élevées d’acide décantoïque (en moyenne 156,7 μM) dans le sérum des enfants atteints d’épilepsie insoluble traités avec un régime MCT pour le contrôle des crises pharmacorésistantes(Haidukewych et al.,1982; Sills et coll.,1986a; Dean et coll.,1989). Une corrélation directe entre les concentrations d’acide décantoïque et le contrôle des crises n’a toutefois pas été démontrée, en partie parce que les études sont trop petites pour démontrer une telle corrélation, mais aussi parce que le régime cétogène peut avoir plusieurs autres actions. Fait important, les souris traitées à l’acide décantoïque par gavage gastrique (30 mmol/kg; Wlaz et coll.,2012) ont augmenté les concentrations d’acide décantoïque du cerveau (jusqu’à 240 μM), qui représentent 60 à 80 % des niveaux de sérum. Ces résultats indiquent que les acides gras sont présents en quantités appréciables dans le sang périphérique et le cerveau et sont donc idéalement placés pour avoir un effet sur le contrôle des crises dans le cerveau. Il a également été démontré que l’acide décantoïque retarde l’apparition de crises cloniques induites par la picrotoxine et prolonge le temps de survie chez les souris atteintes de convulsions induites par le pentylenetetrazol (Nakamura et coll.,1990). En outre, il y a un effet direct des acides gras contenus dans MCT sur l’excitabilité cérébrale(Huttenlocher et autres,1971; Sills et coll.,1986a, b). Comme nous montrons également que l’acide décantoïque inhibe l’activité épileptiforme in vitro,il est probable que l’acide décantoïque est une composante thérapeutique significative de l’alimentation.
Nous avons déterminé l’effet aigu de l’acide décantoïque sur la transmission synaptique dans la zone CA1 de l’hippocampe de rat et avons identifié que l’acide décantique réduisait l’amplitude d’EPSC, à une concentration similaire aux concentrations plasmatiques maximales chez les enfants subissant le régime (300 μM ; Haidukewych et coll.,1982; Sills et coll.,1986a; Dean et coll.,1989) et d’une manière compatible avec un effet postsynaptique. En outre, la même concentration d’acide décantoïque n’a eu aucun effet appréciable sur la transmission inhibitrice. Ces données indiquent que l’acide décantoïque agit aux récepteurs AMPA. Ces récepteurs constituent une cible reconnue pour le contrôle des crises et assurent une médiation rapide de la transmission synaptique glutamatergique dans le SNC( Traynelis et coll.,2010; Rogawski, 2011). Les récepteurs AMPA jouent un rôle clé dans la génération et la propagation de l’activité épileptique et, à long terme, de la plasticité cellulaire adaptative associée à l’épileptogènes (Rogawski et Donovan, 1999; Chapman, 2000). Les récepteurs sont présents dans toutes les régions du cerveau pertinentes à l’épilepsie, y compris le cortex cérébral, l’amygdale, le thalamus et l’hippocampe (Beneyto et Meador-Woodruff, 2004; Rogawski, 2011). En outre, les antagonistes des récepteurs AMPA ont un large spectre d’activité anticonvulsivant dans divers modèles d’épilepsie in vitro et in vivo(Rogawski et Donevan, 1999; Rogawski, 2011). Ici nous montrons que le degré d’antagonisme de récepteur d’AMPA par l’acide décantoïque est suffisant pour expliquer son effet d’antiséizure. De même, perampanel, un traitement récemment approuvé pour l’épilepsie partielle réfractaire, agit par l’antagonisme de récepteur d’AMPA (Rektor, 2013). Ainsi, nos résultats montrant que l’acide décantoïque réduit l’ampleur de la signalisation glutamatergique rapide dans l’hippocampe sont compatibles aux rapports précédents que les récepteurs d’AMPA sont une cible identifiée pour des thérapies d’antiséizure ( Meldrum et Rogawski, 2007; Szenasi et coll.,2008; Russo et coll.,2012).
Les résultats des tranches hippocampiques ex vivo ne distinguent pas, cependant, un effet direct d’un effet indirect de l’acide décantoïque sur les récepteurs AMPA. Pour surmonter cela, nous avons utilisé un modèle d’expression hétérologique, où les récepteurs AMPA ont été exprimés dans les ovocytes Xenopus pour permettre une caractérisation détaillée de l’effet de l’acide décantoïque sur l’activité des récepteurs AMPA. L’acide décantoïque inhibait directement les récepteurs AMPA composés d’homodimers GluA1, et de GluA1/2 et d’hétérodimères GluA2/3 — ces deux derniers représentent les deux combinaisons de récepteurs AMPA les plus abondantes dans le cerveau adulte(Santos et coll.,2009; Wang et coll.,2012). Il est intéressant de noter que les patients présentant l’épilepsie chronique montrent une augmentation significative des sous-unités dendritiques hippocampe GluA2/3 dans les cellules de granule dentâtes(de Lanerolle et autres,1989), et nos données suggéreraient une efficacité améliorée concomitante de l’acide décantique dans cette population. Les sous-unité GluA montrent des changements spatiaux et temporels différentiels dans l’expression des sous-units tout au long du développement (Talos et coll., 2006), et les sous-unités GluA2/3 sont exprimées à des niveaux accrus pendant le développement postnatal (jours postnatals 10-15) dans l’hippocampe de rat (Arai et autres, 1997), et les changements d’expression à long terme suivant le développement de l’épilepsie dans les modèles animaux (Friedman et autres,1994). Ces résultats indiquent que l’acide décantoïque exerce un effet direct sur les courants ampa-médiés, à des concentrations aussi basses que 100 μM (fournissant l’inhibition de ∼20%), suggérant une influence probable sur la fonction neuronale dans les patients sur le régime cétogène de MCT. Cependant, la conclusion que l’acide décantoïque a probablement des cibles thérapeutiques supplémentaires en raison de son effet sur les phosphoinositides (Chang et coll.,2012, 2014a, b), soulève la question de savoir si ce degré d’antagonisme récepteur AMPA est suffisant pour expliquer ses effets thérapeutiques chez l’homme. Perampanel, un antagoniste sélectif des récepteurs AMPA, aux concentrations libres observées pour être efficaces chez l’homme, 30-50 nM (Rogawski et Hanada, 2013), entraîne une réduction de ∼20% de la pente epsp champ(Ceolin et coll.,2012). Cet effet est d’une ampleur similaire à l’effet que nous avons observé avec des concentrations thérapeutiques pertinentes d’acide décantoïque, ce qui indique que l’antagonisme récepteur AMPA peut être suffisant pour expliquer les effets de l’antiséizure chez l’homme (bien que nous ne pouvons pas exclure que son effet sur d’autres cibles pourrait également jouer un rôle).
Nous avons poursuivi notre étude sur l’inhibition des récepteurs AMPA en caractérisant davantage le mécanisme de l’inhibition de l’acide décantoïque, en particulier en déterminant si elle est en concurrence avec le glutamate pour se lier au récepteur AMPA. Ceci est pertinent car dans les conditions où il y a de fortes augmentations des concentrations de glutamate (telles que l’activité de saisie), les inhibiteurs concurrentiels peuvent être moins efficaces. Cependant, nous démontrons clairement que la variation de la concentration de glutamate par un ordre de grandeur ne modifie pas l’IC50 de l’inhibition de l’acide décantoïque, ce qui indique que l’acide décantoïque est un inhibiteur non compétitif aux récepteurs AMPA. La puissance de l’inhibition des récepteurs AMPA dépendants de l’acide décantique est donc indépendante de l’augmentation du glutamate pendant l’activité de saisie et se produira toujours à des concentrations synaptiques de glutamate dans la gamme milli molaire (Clements et coll.,1992). Nous avons également déterminé que l’inhibition des récepteurs AMPA par l’acide décantoïque dépend de la tension et qu’elle est plus efficace dans les potentiels dépolarisés. Cette dépendance de tension suggère que l’effet thérapeutique de l’acide décantoïque en réduisant des courants de récepteur d’AMPA soit augmenté pendant l’activation post-synaptique et la propagation de saisie. Ce résultat suggère également que le site de liaison pour l’acide décantoïque se trouve dans ou près de la région du canal du récepteur et est compatible avec les propriétés des bloqueurs connus de pore de récepteur d’AMPA tels que les polyamines(Washburn et Dingledine, 1996).
Notre modélisation de la liaison de l’acide décantoïque aux récepteurs AMPA suggère également un site contraignant dans la région du canal du récepteur. Nos données indiquent que l’acide décantique se lie au moyen d’une liaison hydrogène entre ses deux oxygènes acides carboxyliques et les deux hydrogènes du groupe cyclique d’amine de proline à la position des résidus 584 sur chacune des quatre sous-unités d’hélices M3 dans le canal ionique. Il est probable que la liaison de l’acide décantique à chacune des quatre sous-unités contribue en coopération à ses effets thérapeutiques. Nous croyons que ce mode d’action fournira à la fois des effets stériques limitant les dimensions physiques du pore du canal iion couplé à des interactions électrostatiques entre le groupe carboxylique chargé négativement et les cations qui circulent à travers le canal ion. Les interactions entre l’acide décantoïque et les cations passant par le canal entraîneraient non seulement un rétrécissement supplémentaire du pore du canal ionique, mais créeraient également un champ électrostatique positif qui pourrait servir à repousser et à empêcher des cations supplémentaires de passer par le canal ionique bloqué. Cependant, les aspects mécanistes précis de la fonction acide décantoïque, y compris l’effet possible sur la désensibilisation des récepteurs, demeurent peu clairs. La localisation distincte de la liaison pour l’acide décantoïque et le perampanel (Szenasi et coll.,2008; Rogawski, 2011) suggère différents profils inhibiteurs et, éventuellement, des effets cliniques. Cela peut expliquer pourquoi certains effets néfastes du perampanel, tels que l’agressivité accrue ( Rugg -Gunn, 2014; Steinhoff et coll.,2014), ne sont pas si évidents avec le régime cétogène mct. En outre, comme le perampanel et l’acide décantique agissent à des endroits distincts, il est possible qu’ils aient un effet coopératif au récepteur AMPA, ce qui suggère que le permapanel et le régime cétogène pourraient être synergiques.
Nos résultats ont des implications cliniques de grande envergure. Pour le syndrome de Lennox-Gastaut, le syndrome de Doose et les médicaments antiépileptiques du syndrome de Dravet sont souvent insuffisants pour obtenir un contrôle des crises et des interventions non pharmacologiques sont souvent nécessaires. Ici, le régime MCT peut être efficace dans la gestion des crises (Kossoff et Rho, 2009; Vanstraten et Ng, 2012; Laux et Blackford, 2013), et l’apport alimentaire accru en acide déccanoïque peuvent fournir des avantages thérapeutiques supplémentaires. En outre, le traitement des adultes atteints d’épilepsie pharmacorésistante, qui montrent une mauvaise conformité au régime alimentaire rigoureux nécessaire pour le régime mct, peut mieux tolérer un régime alimentaire normal avec de l’acide décantique vient d’être ajouté, par exemple sous la forme d’un triglycéride.
Il y a une gamme de limitations à la découverte d’un effet aigu de l’acide décantoïque sur le contrôle de saisie. Tout d’abord, il est probable que l’acide décantoïque a également des effets chroniques, comme cela a été montré récemment sur la prolifération mitochondriale (Hughes et coll.,2014), et ces effets peuvent également avoir des rôles dans la fonction thérapeutique de l’acide décantoïque. En outre, le rôle du métabolisme sur des niveaux sanguins élevés d’acide décantique (Rho et Sankar, 2008; Rho et Stafstrom, 2011) reste incertain. Une réduction de la charge en glucides est-elle nécessaire pour des niveaux élevés d’acide décantoïque sanguin? Des études récentes ont suggéré que l’huile diététique de MCT, concomitante avec un régime non restreint de hydrate de carbone, a donné lieu à la cétose(Courchesne-Loyer et autres,2013), bienque des changements dans les acides gras moyens spécifiques de chaîne dans le plasma n’aient pas été déterminés. Les études futures surveillant l’acide décantoïque dans le plasma des patients ou des individus en bonne santé sur différentes huiles de MCT de composition, ou avec des prises différentes d’hydrate de carbone, devraient fournir des indications des conditions diététiques nécessaires pour élever des niveaux d’acide décantique de plasma pour fournir la protection de saisie par l’inhibition directe de récepteur d’AMPA.
L’effet direct de l’acide décantoïque sur les courants médiés par les récepteurs AMPA soulève une préoccupation d’un effet néfaste sur la fonction cognitive. De nombreuses études ont démontré que les récepteurs AMPA contribuent au renforcement synaptique pendant la potentialisation à long terme, un modèle cellulaire de plasticité synaptique et de plasticité neuronale dépendante de l’expérience (Talos et coll.,2006; Santos et coll.,2009; Wang et coll.,2012). Ceci est en outre soutenu par des modèles de souris, n’ayant pas le gène codant pour le sous-unité GluA1 (Gria1) présentant une mémoire altérée dépendante de l’hippocampe (Sanderson et coll.,2008). Cependant, ni les antagonistes concurrentiels ni non concurrentiels des récepteurs AMPA (à des concentrations qui inhibent l’activité des crises) n’ont eu d’effet sur la potentialisation à long terme (une corrélation cellulaire de l’apprentissage et de la mémoire) (Sanderson et coll.,2008), ce qui est compatible avec les données in vivo dans lesquelles les antagonistes des récepteurs AMPA à des doses thérapeutiques n’affectent pas la cognition (Pan et coll.,2010). En effet, chez l’homme, il a été démontré que le régime cétogène du MCT a divers effets positifs sur la fonction cérébrale, comme une vigilance accrue, un meilleur fonctionnement cognitif et un meilleur comportement, et non seulement chez les patients épileptiques ( Kinsman et coll.,1992; Pulsifer et coll.,2001) mais aussi chez les patients atteints de diabète de type 1 ayant reçu une perfusion d’insuline ( Page et coll.,2009). La mesure dans laquelle ces effets peuvent être attribués à l’acide décantoïque ou à d’autres composants de l’alimentation reste à déterminer.
Financement
Nous reconnaissons avec gratitude une subvention du NC3Rs G0900775 à R.S.B.W. et M.W. pour soutenir cette recherche, et l’étudiant au doctorat à K.A. par Vitaflo Ltd. P.E.C. est reconnaissant pour le financement de la Royal Society. Une partie de ce travail a été entreprise à l’UCLH/UCL, qui reçoit une partie du financement du programme de financement des Centres de recherche biomédicale des NIHR du ministère de la Santé.
